产品货号:
KL00221
中文名称:
通用型LAMP试剂盒(可视染料法)
英文名称:
Universal LAMP kit
产品规格:
50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒含有可视化LAMP扩增所需的所有成分,可以用于可视化LAMP等温扩增。
LAMP即环介导等温扩增,它利用4条模板专一的特异引物和具有链置换能力的Bst DNA聚合酶,在等温条件下(63℃左右) 30~60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性PCR技术,同时还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测,广泛用于各个领域。
保存:-20℃,有效期1年。
使用方法
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LAMP即环介导等温扩增,它利用4条模板专一的特异引物和具有链置换能力的Bst DNA聚合酶,在等温条件下(63℃左右) 30~60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性PCR技术,同时还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测,广泛用于各个领域。
- 即开即用,含有可视化染料,扩增后可以直接肉眼观察,不需要仪器设备。
- 高特异性,精心优化的配方,非特异扩增比自配的试剂更低。
- 4×MasterMix,比对应的2×MasterMix能使用能多的扩增模板。最多可达11μL,降低漏检的机率。
- 高扩增效率,一般比PCR灵敏一个数量级。
- 65℃左右等温扩增,不需要贵重仪器。
- 本试剂盒足够50次20μL体系的LAMP扩增。
- 提供扩增对照,便于在遇到困难时分析原因。
- 本制品只能用于科研,不能用于临床。
组分 | 规格 |
4×LAMP MasterMix(含可视染料) | 200μL |
Bst DNA聚合酶 | 50μL |
阳性对照模板-引物混合物 | 50μL |
保存:-20℃,有效期1年。
- 引物设计对成功扩增十分关键,尽量以保守区设计引物。
- 引物至少包括F3/B3和FIP/BIP,加入环状引物F loop/B loop可以使反应速度大大提高。
- 应优化引物序列、GC含量和尽量避免二级结构。
- LAMP扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此,必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染,很难去除,最好重新设计引物扩增新的靶片段。
使用方法
- 制备模板DNA:用于选用合适的方法制备模板DNA。如果有N个样品,最好设置N+2个样品制备,多出的两个一个是样品制备阳性对照,一个是样品制备阴性对照。
- 配制5×LAMP引物混合液。
先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到标准所标注的母液浓度,然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水,最后得到1mL的5×LAMP引物混合液,此混合液足够250次20μL体系的LAMP扩增。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积异于1mL,则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
注:如果没有Loop引物,则用水替代。引物名称 母液浓度 加母液量 在5×LAMP引物混合液中的浓度 FIP引物 100μM 80μL 8μM BIP引物 100μM 80μL 8μM F3引物 100μM 10μL 1μM B3引物 100μM 10μL 1μM Loop F 100μM 20μL 2μM Loop B 100μM 20μL 2μM 超纯水 780μL 终体积 1mL - 在冰上融化4×LAMP MasterMix(含可视染料),混匀,稍离心。第一次使用时,请将50μL Bst DNA聚合酶全部加入到4×LAMP MasterMix中轻柔混匀,然后再使用。如果有N个样品,则在N+2个反应管中加入以下组份,多出的一管是LAMP扩增阳性对照(PC),一管是LAMP扩增阴性对照(NC):
成分 N+2个样品管 LAMP扩增PC LAMP扩增NC 4×LAMP MasterMix(加酶后) 5μL 5μL 5μL 自备5×LAMP引物混合液 4μL 不加 4μL 阳性对照模板-引物混合物 不加 4μL 不加 自备模板DNA 1~11μL 不加 不加 自备超纯水 至20μL 至20μL 至20μL - 混匀,置于65℃保温60分钟。如果是在PCR仪中保温,必须加热盖。如果用金属浴或水浴保温,没有热盖,必须覆盖50μL的石蜡油,否则保温期间反应体系的水分会蒸发,严重影响反应效率。
- 扩增结束后肉眼观察结果判断阴性和阳性。典型的结果见下图:左边管为阴性,右边两个管为阳性。
- 结果分析:如果本试剂盒提供的阳性对照-引物混合物呈现阳性而阴性对照为阴性,则实验有效。如果阳性对照-引物混合物呈现阴性,则操作有问题或者试剂盒有问题,请跟厂家联系。如果阴性对照(水作为模板)也呈现阳性,则说明LAMP样品或试剂有过去的扩增产物的污染,需要注意操作的规范性,如果不能解决,可以重新设计引物扩增新的靶片段。
- 也可以电泳检测实验结果(强烈不推荐此法,因为电泳时产生的气溶胶非常容易污染环境,使得今后用同一引物扩增时产生假阳性):取5~10μL扩增产物和自备的上样液混合,上样,进行2~3%的琼脂糖凝胶电泳,有LAMP扩增的样品将可见LAMP特征性电泳图谱。
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